前情集锦：

上面欧宝体育官方 简介了肌动蛋白酶阳极氧化的一些理论深入分析重大突破，你这个范围的理论深入分析相对于讲还比效少同时还有越来越多引起深入深入分析的空间，癌神经元骨架理论深入分析范围的专家团队生产商Cytoskeleton设计了几代最火款式Actin，全力于给癌神经元骨架理论深入分析者们具备更好的的欧宝体育官方 ，以四轮驱动孩子们来进行更深刻层次分的理论深入分析，接下来，欧宝体育官方 一方面来认识下面一些的游戏背景生活常识：

芘标记的Actin用于肌动蛋白聚合检测：

肌动血清整合方面的测评是评介类化合物对肌动血清模块印象的某种迅猛管用的的的方法，到现有到止，最通用版、最敏🦩感性、最会动用的的的方法是Fluorescence enhancement of pyrene conjugates——芘共轭物的荧光提高法来分辩整合方面，它其中包括将你的差表品和测评品与大量的芘依照的肌动血清混合式，最后做好整合，芘-肌动血清聚己内酯依照成整合物方式后，荧光会提高到20倍（见图2）。

图2. 芘标记的Actin聚合过程中的荧光增强。通过添加Actin聚合缓冲液（），芘标上的肌肉群肌动蛋白质在96孔板中汇聚 ，1分钟内至少秒钟扫描仪一次性荧光网络信号。汇聚的 F💯-actin与未汇聚的芘标上G-actin和對照缓存数据液质比荧光资料10倍。

肌动蛋白聚合分为三个阶段，♐成核期（lag phase）👍、生长期（growth phase）和稳定期（steady state phase），如图2所示，聚合程度由稳定期的荧光水平来表示。

MICAL（MIC01）是一种细胞内的黄酮蛋白单加氧酶，从昆虫到哺乳动物都很保守，它在氧化还原（red𓄧ox）反应中起催化剂的作用。Terman的小组阐明了MICAL与F-actin之间存在相互作用：在使用NADPH作为辅因子情况下，MICAL可氧化肌动蛋白上的Met44和Met47（第44位和47位的甲硫氨酸）位点，Cytoskeleton已经从细菌表达系统生产并纯化了人类MICAL1蛋白𝄹，重组蛋白被N-末端6xHis标记，由全长蛋白的Redox和CH结构域（aa：1-612）组成，验证研究表明，MICAL1可以氧化肌动蛋白，从而在蛋白水解测定中将枯草杆菌蛋白酶A的剪切减少90％以上。

MsrB2（MB201）是一种蛋白质，可以还原肌动蛋白上第44位和47位甲硫氨酸（M44和M47），MsrB2在还原肌动蛋白的过程中被氧化，可通过DTT还原再生，当肌动蛋白的M44位点被氧化时，其聚合能力显著降低；相反，当被氧化的肌动蛋白在M44位点被还原时，𝓰其聚合能力会恢复，肌动蛋白聚合试验可用于检测MICAL氧化肌动蛋白与MsrB2还原肌动蛋白对Actin聚合的影响。

枯草杆菌素A是一种蛋白酶，已被证明能在M47和G48之间特异性地切割肌动蛋白。当肌动蛋白的M47位点被MICAL氧化时，枯草杆菌蛋白酶A切割的效率显著降低；反之，当肌ꦰ动蛋白的M47位点被MsRB2（+DTT）还原时，枯草杆菌蛋白酶A的切割效率显著提高。因此，枯草杆菌素A可通过评估切割与未切割的肌动蛋白，以确定MsrB2活性及对M47和M44的还原效率。

MICAL-1对Actin聚合的影响分析：

	MICAL-1（MIC01）蛋白纯度测定 :   通过在4- 20％Tris-甘氨酸凝胶中电泳分离10μg MICAL-1蛋白样品，并用考马斯亮蓝染色, 使用Precision RedTM蛋白测定试剂进行蛋白定量。
	MICAL-1氧化的肌动蛋白的枯草杆菌蛋白酶A检测：   肌动蛋白（AKL99）对照组 NADPH（400 m M）+Actin处理组 MICAL（0.076 m M）+Actin处理组 NADPH+ MICAL +Actin处理组 然后全部用枯草杆菌蛋白酶A(不)处理15min结果： 在NADPH和MICAL共同存在的情况下， 用枯草杆菌蛋白酶A处理后，被切割ꦬ的肌动蛋白表达量显著ಌ下调，NADPH或MICAL单独存在时与阴性对照无显著差异。
	MICAL-1对Actin聚合的影响： 用MICAL（MIC01） + NADPH清理区别渗透压的非人工肌动蛋白质（AKL99），然后将样品在超速离心机中100,000 g离心1.5 h。 结果：MICAL + NADPH处理后，沉淀（pel,, 主要为actin聚合体）蛋白表达量显著高于上清液（sup, 主要为actin单体）。 表明Actin浓度为0.1g / ml时，MICAL + NADPH能将肌动蛋白聚合程度降低50%；浓度为0🍬.4m g / ml时，MICAL + NADPH能将肌动蛋白聚合程度降低约20%。
	MICAL-1对Actin聚合的影响（荧光检测） ：   芘标记的肌动蛋白（AP05）作为对照组 NADPH处理 MICAL（MIC01）处理 NADPH + MICAL（MIC01）处理结果：NADPH + MICAL（MIC01）各自操作，聚合反应反应身材曲线荧光值相关系数调低.，反映出NADPH + MICAL各自操作性能调低肌动血清聚合反应反应成度。

MICAL氧化Actin与天然Actin对比分析： 

	MICAL氧化Actin与天然Actin的枯草杆菌蛋白酶处理对比：   将芘标记的肌动蛋白（AP05）和MICAL被氧化的芘标签肌动淀粉酶（MXAP95）稀释至0.1 mg / ml（2.3 mM）。然后用枯草杆菌蛋白酶A（不）处理15min， 结果：与天然肌动蛋白相比，MICAL氧化的🌠肌动蛋白，用枯草杆菌蛋白酶A处理后，被切割的肌动蛋白表达量显著下调。
	氧化Actin与天然Actin的肌动蛋白聚合分析对比：   不同浓度芘标记的天然肌动蛋白（AP05）和MICAL氧化肌动蛋白与聚合缓冲液一起孵育。 结果： 浓度为0.05g / ml时，MICAL氧化肌动蛋白不会聚合，而天然肌动蛋白则能够很好地聚合； 浓度为0.1m g / ml时，MICAL氧化肌动蛋白可聚合至天然肌动蛋白的约50％。 表明MICAL氧化肌动蛋白临界聚合浓度比未修饰形式更高。

MICAL氧化Actin的MsrB2处理分析：

	MsrB2蛋白纯度测定：   通过在4-20％tris-甘氨酸凝胶中的电泳分离10μg MsrB2蛋白样品，并用考马斯亮蓝染色。使用Precision Red TM蛋白测定试剂进行蛋白定量。
	MsrB2处理的氧化Actin的枯草杆菌蛋白酶A分析： MICAL氧化的肌动蛋白（MetO肌动蛋白）（欧宝体育官方:Cat＃MXA95）对照组 DTT（10 mM）处理组 MB201（0.3 m M）处理组 DTT+MB201混合处理组 结果：MsRB2（Mb201）+DTT还原成的钝化型肌动球淀粉酶将促进枯草杆菌球淀粉酶酶A打孔机钝化Actin，而DTT分次意义不能影响力枯草杆菌球淀粉酶酶的打孔机。
	MsrB2对氧化Actin聚合的影响 ：   用MsRB2 + DTT处理不同浓度的MICAL氧化的肌动蛋白（MetO肌动蛋白），然后将样品在超速离心机中100,000 g离心1.5 h。结果：MsRB2 + DTT处理后，沉淀（pel, 主要为actin聚合体）蛋白表达量显著高于上清液（sup, 主要为actin单体），表明M꧑sRB2 + DTT能𓆏还原氧化的Actin，从而增强肌动蛋白的聚合。
	MsrB2对氧化Actin聚合的影响（荧光检测） ： MsRB2（Mb201）+DTT解决MICAL空气氧化的芘标注的肌动球蛋白（MXAP95）后，荧光手机信号会在1H内灰复到与绿色芘标志的肌动蛋清相等于的质量（AP05），而DTT简单办理Actin缔合能力素质都不会恢复原状。

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